alteraciones en el gen ATM en pacientes de leucemia linfocítica crónica inducen una expresión de genes distintos

alteraciones en el gen ATM en pacientes de leucemia linfocítica crónica inducen una expresión de genes distintos

Fondo

La caracterización genética de células de leucemia linfocítica crónica se correlaciona con el comportamiento, la progresión y la respuesta al tratamiento de la enfermedad.

Diseño y Métodos

resultados

conclusiones

Cajero automático alteraciones están presentes en el diagnóstico en aproximadamente 25% de los individuos con leucemia linfocítica crónica; estas alteraciones están asociadas con un patrón de expresión génica peculiar y un intervalo libre de tratamiento más corto.

Palabras clave:Cajero automático. leucemia linfocítica crónica, perfiles de expresión génica, MLPA, del11q

Introducción

Varias propiedades biológicas y genéticas de las células leucémicas, como el estado mutacional de los genes variables de inmunoglobulina de cadena pesada (IGHV ), 2 aberraciones cromosómicas, 3 CD38 y ZAP-70 expresión, 4. 5 y disfunción p53, 6 tener un importante valor pronóstico y han permitido a los pacientes se estratificaron en categorías de riesgo. Estos parámetros son de hecho importantes predictores independientes de progresión de la enfermedad y la supervivencia.

Diseño y Métodos

los pacientes de leucemia linfocítica crónica

Todas las muestras se analizaron para CD38 y la expresión de ZAP-70, por IGHV estatus y para TP53 mutaciones descritas anteriormente. 21

Se extrajo el ADN de las células leucémicas de los pacientes y tumor no relacionado ADN 57 se analizó para determinar Cajero automático mutaciones. el detectada Cajero automático alteraciones fueron investigados en el ADN de las células bucales de pacientes emparejados para determinar su línea germinal o somática naturaleza.

La desnaturalización análisis de cromatografía líquida de alta resolución de la Cajero automático gene

análisis de la sonda de amplificación multiplex ligadura de la Cajero automático gene

Este ensayo consiste en dos mezclas de reacción que contienen sondas para 33 de los 66 constitutiva Cajero automático exones y control de sondas para secuencias localizadas en otros genes. Una parte alícuota de 150 ng de ADN genómico desnaturalizado se utilizó en el recocido durante la noche de las sondas específicos de exón y reacción de ligación subsiguiente. PCR se realizó con los cebadores marcados con FAM utilizando 10 ml de reacción de ligación. Los productos de amplificación se separaron y cuantificaron utilizando un ABI Prism 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystem). El área del pico para cada fragmento se midió con software V.3.7 Análisis GeneScan (Applied Biosystems) y los datos se analizaron con el software Coffalyser (MRC-Holland). Los resultados se presentan como la relación entre el número de copias del alelo (número de copias relativo) de las células de un paciente con CLL y controles sanos. Una proporción de 1 debe obtenerse si ambos alelos están presentes; una reducción o un aumento en los valores de área de pico de 0,7 o 1,3 se consideró una indicación de una deleción o una duplicación, respectivamente.

El análisis estadístico de intervalo libre de tratamiento

La extracción de RNA y de microarrays de oligonucleótidos

El ARN total se extrajo usando el procedimiento RNeasy mini (Qiagen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todas las muestras analizadas contenían al menos un 90% de células leucémicas. Se utilizaron HGU133 Plus chips de genes 2.0 (Affymetrix, Santa Clara, CA, EE.UU.) para determinar los perfiles de expresión génica. Se proporcionan más detalles en el Diseño complementaria en línea y Métodos .

Métodos estadísticos para el análisis de microarrays

Se aplicó una prueba t para identificar genes expresados ​​diferencialmente entre las diferentes subclases de CLL: se requiere sonda fija para tener una expresión media de más de 100 en al menos un grupo, una PAG valor de 0,05 o menos y un cambio múltiplo de 1,5 o más. anotaciones funcionales de genes se identificaron utilizando la base de datos DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov ).

En tiempo real de la polimerasa cuantitativa análisis de reacción en cadena de

Un microgramo de ARN total fue transcrito invertir usando la Advantage RT-PCR Kit para-(Clontech, Mountain View, CA, EE.UU.). cuantitativa-PCR análisis en tiempo real (Q-PCR) se realizó con un PRISM 7500 sistema de detección de secuencias ABI y tinte verde SYBR (Applied Biosystems). Los cebadores fueron diseñados utilizando el software Primer Express 1.5.1 (Applied Biosystems).

Se proporcionan más detalles en el Diseño complementaria en línea y Métodos ; los símbolos de genes y los cebadores se enumeran en Suplementario en línea Tabla S2 .

El modelado molecular del dominio quinasa ATM

Para evaluar la congruencia del modelo arquitectónico propuesto, se verificó también si los aminoácidos esenciales para la actividad quinasa están correctamente situados en el interior de la estructura. Específicamente, hemos identificado la posición de la lisina que interactúa con el grupo fosfato del ATP y el ácido aspártico, que actúa como aceptor de protones, que son los dos residuos del sitio activo que participan directamente en la actividad de quinasa. El primero de estos dos residuos en ATM parece ser el invariante Lys2717, porque se alinea con precisión con Lys833 de PI3K porcina, que a su vez se conoce como la lisina del sitio activo para esta quinasa homóloga. 27 El residuo aceptor de protones en ATM resulta ser el invariante Asp2870 dada su coincidencia geométrica con el residuo de ácido aspártico catalítico anotado de otra quinasa caracterizan estructuralmente (PDB estructura 1VYW, la división celular de la proteína quinasa 2) que se observa después de superposición rígida de este último estructura con nuestro modelo.

resultados

La desnaturalización análisis de cromatografía líquida de alta resolución de mutaciones ATM

Cajero automático mutaciones puntuales de genes en pacientes con LLC.

Además, nueve variantes o polimorfismos diferentes, definidos en la base de datos de referencia, se encontraron en 14 pacientes (Suplementario en línea Tabla S3 ); su importancia funcional es desconocida. Cajero automático mutaciones, variantes y polimorfismos también se evaluaron en 180 voluntarios sanos, para poner a prueba, en controles de la misma, tanto si estas variantes se segregan en la población italiana y para determinar su frecuencia (Suplementario en línea Tabla S3 ).

análisis de la sonda de amplificación multiplex para la ligadura Cajero automático deleciones / duplicaciones

Relación entre Cajero automático mutaciones genéticas y factores pronósticos

Los pacientes con Cajero automático mutaciones puntuales

Análisis de la secuencia de IGHV genes en los ocho Cajero automático -casos mutados mostraron que seis habían no mutada IGHV y dos (MR 3664; AE 5646) había mutado IGHV ( Tabla 2 ).

características biológicas y clínicas de los pacientes con LLC estudiados.

Seis pacientes estuvieron en la etapa A y dos en la etapa B (GF 3706; PD 3988); tres pacientes (AE 5646; GF 3706; 3988) PD tenían adenopatías. En el momento de análisis de datos, seis de los ocho pacientes con Cajero automático mutación tenía sometido a tratamiento (MR 3664; PD 3988; GF 3706; ID 5637; CG 5116) y la mediana del intervalo libre de tratamiento fue de 30,0 meses.

Los pacientes con Cajero automático supresiones

Todos los seis pacientes habían no mutada IGHV. CD38 fue positiva en cuatro de los seis casos (CS 5700; PF 5216; PA 5704; VR 3835), y en todo más de 20% de las células leucémicas expresan el antígeno. ZAP-70 fue positivo en todos los casos.

Cinco pacientes estuvieron en la etapa A y uno en la fase B (CC 5394); cuatro pacientes (CC 5394; CS 5700; PF 5216 VR 4046) tenían adenopatías. En el momento de análisis de datos, todos los pacientes eliminados 11q23 habían sido tratados y la mediana del intervalo libre de tratamiento fue de 23,5 meses.

Los pacientes sin Cajero automático mutaciones o deleciones

Cuarenta y tres de los casos de CLL 57 analizados no mostraron Cajero automático mutación genética o 11q23 deleción (Tabla 2). Dos pacientes tuvieron del17p13, pero sólo uno en más de 20% de las células leucémicas, y un paciente tenía una TP53 mutación genética. En 16/43 (37%) de los casos, no mutada IGHV se registró el estado del gen. CD38 fue positivo en 8/43 (19%) casos y ZAP-70 se expresó en 12/39 (31%) pacientes. Treinta y un pacientes estuvieron en la etapa A, nueve en la etapa B y tres en la etapa C. En el momento del análisis de datos, 26/43 pacientes habían sido tratados y la mediana del intervalo libre de tratamiento fue de 64,2 meses. Cuando Cajero automático -mutados y los pacientes eliminados se compararon con pacientes sin Cajero automático alteraciones, la diferencia en el intervalo libre de tratamiento fue estadísticamente significativa (PAG = 0,0032) (Figura 1).

El análisis estadístico de la supervivencia libre de tratamiento. Evaluación del intervalo libre de tratamiento en Cajero automático -mutados y los pacientes con LLC suprimido en comparación con los pacientes sin Cajero automático alteraciones.

el análisis de microarrays en células de leucemia linfocítica crónica con Cajero automático mutaciones puntuales

Para evaluar los efectos de Cajero automático Las mutaciones en las células de LLC, se realizó un análisis de perfil de expresión génica en 41 de los 57 pacientes con LLC con conocidos Cajero automático estado mutacional. En primer lugar, utilizamos un enfoque no supervisado la aplicación de criterios de filtrado no específicos: agrupamiento jerárquico basado en una lista de 226 genes seleccionados mostró que tres de los cinco Cajero automático -casos mutados fueron incluidos en el mismo grupo de pacientes; Es de destacar que dos muestras albergaban la misma Cajero automático mutación (1435GT) (datos no mostrados ).

Posteriormente, se realizó un análisis supervisado comparando el Cajero automático -los casos con las muestras de CLL restantes mutado; como se muestra en la Figura 2A. este enfoque reveló un patrón común de expresión para los casos de LLC con Cajero automático mutaciones, la identificación de un conjunto de 32 genes expresados ​​diferencialmente. Entre éstos, se encontraron varios genes implicados en la transducción de señales (TGFBR3. AXIN2. CD180. GABRB2. BACE2 ), La regulación de la transcripción (RXRA. eIF4A. XBP1 ), La angiogénesis (LAMA5. COL4A3. TMPRSS6 ), La apoptosis y la regulación del ciclo celular (SRGN. LY86. SEPT10 ) (Suplementario en línea Tabla S4 ). Sorprendentemente, se obtuvieron resultados similares cuando la misma comparación se realizó con exclusión de los casos MLPA-positivos (datos no mostrados ): Este enfoque se realizó para demostrar que la firma de Cajero automático mutaciones es independiente de 11q23 supresiones.

Comparación entre Cajero automático -mutado y pacientes con LLC no mutado. genes expresados ​​diferencialmente entre Cajero automático -mutado y Cajero automático De tipo silvestre analizados (WT) casos en todos los pacientes con LLC (A) y en IGHV los sujetos no mutadas (B). leyenda superior: el verde representa Cajero automático -mutado .

el análisis de microarrays en células de leucemia linfocítica crónica con Cajero automático supresiones

El análisis no supervisado en muestras de LLC destacar que cuatro de los seis pacientes MLPA-positivos fueron incluidos en el grupo con Cajero automático -muestras mutadas mencionados anteriormente (datos no mostrados ).

Posteriormente, se realizó un análisis supervisado usando una prueba t entre los casos MLPA-positivas y las otras muestras de LLC, con independencia de Cajero automático mutaciones (Figura 3A). Esta comparación identificó 98 genes expresados ​​diferencialmente, como se informa en la Suplementario en línea cuadro S5. Entre los grupos funcionales más importantes, encontramos diferentes genes implicados en la transducción de señales (TCL1A. P2RX1. CNR1. IL10RA. CXCR5. CACNA1A. FMOD. TXNDC5 ), La regulación de la transcripción (RXRA. IMC1. ZNF92. NR4A2. eIF3c. hoxc4. ZNF331 ), Adhesión celular (PCDH9. SIGLEC10. VCL. LY9. COL18A1. CNTNAP2 ), Metabolismo de los lípidos (ÁPODO. ALG13. NPC2. FDX1. ALOX5. TSPO. PAFAH1B2. NRIP1 ) Y la organización del citoesqueleto (DMD. ADD3. TUBB6 ).

La comparación entre los pacientes MLPA MLPA + y con LLC. La identificación de 98 genes expresados ​​diferencialmente entre los casos de MLPA + y las muestras de CLL restantes. leyenda superior: representa púrpura MLPA casos, fundas + MLPA de color verde claro (A). Correlación .

Por otra parte, nuestros resultados pusieron de relieve una firma más distintivo asociado con Cajero automático deleciones, junto con un efecto de dosis génica concomitante. De hecho, entre los genes modulada hacia abajo, detectamos expresión reducida de varias transcripciones localizadas en la región del cromosoma 11q22-q23, tales como Cajero automático. FDX1. MLL. Cul5. IL10RA. BIRC3. CXCR5. UBE4A. TMEM123. CCDC84. PAFAH1B2. CWF19L2 y KIAA0999 genes.

En línea con estos descubrimientos, la disminución de los niveles de expresión de este conjunto de genes correlacionado con el porcentaje de células que llevan la deleción (Figura 3B).

Por otra parte, como ya se ha hecho por Cajero automático mutaciones, con el fin de excluir los efectos de IGHV estado mutacional, el mismo análisis se realizó exclusivamente en muestras de LLC con mutada IGHV. lograr resultados análogos (datos no mostrados ).

Para validar los resultados de microarrays, se realizó un análisis Q-PCR en cinco pacientes con LLC con Cajero automático mutaciones, cinco casos MLPA-positivos y cinco CLL sin Cajero automático alteraciones. Como era de esperar, el índice de correlación de Pearson entre la expresión génica y Q-PCR CT Los valores fue alta, lo que confirma una buena concordancia de los resultados de estas dos técnicas.

Por otra parte, también se evaluó la expresión de una serie de transcripciones comúnmente desregulados en la LLC con Cajero automático alteraciones. De acuerdo con los datos de expresión génica, BACE2 y TMPRSS6 fueron significativamente las reguladas en tanto Cajero automático -mutado y pacientes eliminado, mientras que PCDH9 y RXRA fueron modulada de manera opuesta en estas dos subclases comparación con el otro CLL (En línea que complementa la figura 2C ).

Por último, cuando extendemos el análisis de una cohorte adicional de casos, incluyendo cinco con CLL Cajero automático mutaciones puntuales y cinco CLL con del11q, se obtuvieron resultados comparables (datos no mostrados ).

Modelado de las mutaciones de la proteína ATM

Dadas tales efectos importantes en una región crítica para la unión de la co-factor, se espera que cada mutaciones R2691C y P2699S a poner en peligro la actividad quinasa de ATM.

modelado I826L no se evaluó ya que la mutación se encuentra fuera del dominio de la PI3K-similares.

Discusión

Nuestros resultados sugieren que la Cajero automático gen se comporta como el TP53 gen: 19 deleciones y mutaciones pueden ser procesos independientes, pero ambos afectar el pronóstico. Teniendo en cuenta las dos deleciones y mutaciones de Cajero automático. estas alteraciones están presentes en una proporción muy significativa de los pacientes con LLC en la presentación (24,6%). Cabe destacar que, en este estudio se investigaron sólo pacientes de 65 años o menos, y esto podría explicar la frecuencia de las mutaciones. 30. 31

Se ha informado recientemente de que otros genes (es decir, NCAM1. TTC12. ANKK1. DRD2. TMPRSS5. ZW10. USP28. HTR3B. HTR3A. PLZF. NNMT. C11orf71. RBM7. REXO2. FAM55A. FAM55B y TSLC1 ) Se incluyen en la región mínimamente borrado en 11q; 35 en nuestra cohorte, estas transcripciones fueron abajo modulada, pero sin diferencias significativas en comparación con toda la serie CLL.

Del mismo modo, Ouillette et al. 36 identificaron una asociación frecuente entre Cajero automático deleciones y pérdida de monoallelic Mre11 y / o H2AFX ; de acuerdo con estos resultados, los niveles de ARNm eran más bajos, pero no de manera significativa, en los casos con del11q comparados con las otras muestras de LLC.

El perfil de expresión genética peculiar de Cajero automático -pacientes mutados y eliminados se confirmó cuando el análisis se limitó a IGHV casos no mutadas, lo que sugiere que Cajero automático alteraciones de los genes por sí solos pueden inducir los cambios de expresión génica.

Nuestros resultados sugieren que ambas deleciones y mutaciones de la Cajero automático gen afecta el perfil de expresión génica. Sin embargo, los genes implicados son diferentes en los dos grupos, con sólo cuatro genes desregulados comúnmente en ambos pacientes con LLC con tanto mutado y eliminan Cajero automático. lo que indica que, en el plano biológico, diferentes mecanismos pueden estar implicados en la alteración de la vía ATM, pero proporcionan un efecto clínico adverso similar.

Las diferencias observadas en el perfil de expresión de genes entre las Cajero automático -células leucémicas mutados podrían ser la consecuencia de mutaciones en diferentes regiones de codificación. De hecho, las mutaciones observadas en los casos analizados aquí se producen en diferentes exones, que conduce a la desregulación de los diferentes dominios de la proteína ATM: dado el pequeño número de pacientes, una comparación del perfil transcripcional de las diferentes mutaciones no era factible, aunque esto enfoque podría ser útil para entender la consecuencia funcional de cada mutación.

Dos pacientes portadores de la mutación D479T cayeron en el mismo grupo de perfiles de expresión génica sugieren que la mutación podría desempeñar un papel en el comportamiento de las células leucémicas, aunque no se ha informado de ninguna otra prueba sobre el papel de esta mutación.

Notas al pie

La versión en línea de este artículo tiene un anexo complementario.

Autoría y Revelaciones

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Se proporcionan artículos de Haematologica aquí por cortesía de Fundación ferrata Storti

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